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Posters iPS ICAN au printemps de la cardiologie 2021

 

Deux communications issues du travail de la plateforme iPS de l’IHU-ICAN ont été sélectionnées en tant que poster au congrès national du Printemps de la cardiologie qui a eu lieu le 27 et 28 mai 2021 :

Generation of mature and functional vascular endothelial cells from human pluripotent stem cells

marquage CD31 sur cellules endothéliales dérivées d’iPS

L’utilisation de cellules souches pluripotentes humaines (iPS) pour la modélisation in-vitro de maladies et des applications en toxicologie nécessite des protocoles qui différencient ces iPS en cellules adultes matures avec un rendement élevé. Nous avons décrit ici une méthode de différentiation rapide et efficace d’iPS humaine en cellules endothéliales vasculaires matures.

Nous avons trouvé une combinaison de molécules qui permet une différenciation rapide des iPS en cellules endothéliales avec  un rendement de 80% en six jours. Les cellules sont triées avec le marqueur VECadherin afin d’obtenir la population la plus pure possible. Les cellules obtenues ont été caractérisées par différentes méthodes : cytométrie CD31, Immunofluorescence CD31, CD144, vWF.

Les cellules endothéliales ont ensuite été caractérisées fonctionnellement : capacité des cellules endothéliales à former des capillaires dans le matrigel, captation des LDL oxydés et formation de jonctions serrées donnant une monocouche cellulaire étanche au passage des molécules qui est déstabilisée par le traitement de la thrombine. Enfin, ces cellules ont un phénotype anti-thrombotique évalué par la technique de génération de thrombine en présence de plasma.

Les résultats suggèrent que ces cellules endothéliales sont matures phénotypiquement et fonctionnellement et pourraient être utilisées pour la modélisation in-vitro de maladies et des applications en toxicologie sur les paramètres étudiés.

 

Generation of iPSC line from MYH7 R403L mutation carrier with HCM and isogenic CRISPR/Cas9 corrected control

Cardiomocytes issus d’iPS : marquage vert: a-actinine et rouge: troponine T

La cardiomyopathie hypertrophique (CMH) est une maladie cardiaque relativement fréquente (1/500) qui peut entraîner une arythmie et une mort subite. Elle est principalement causée par des mutations génétiques de protéines du sarcomère. Les mécanismes de la maladie sont encore mal connus en raison de l’accès limité aux modèles expérimentaux humanisés. Les cardiomyocytes dérivés de l’iPSc de patients mutés pourraient servir de support pour modéliser la maladie et aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le but de l’étude a été de dériver et différencier en cardiomyocytes une lignée d’iPSc d’un patient présentant une mutation « hotspot » en CMH et son contrôle isogénique.

Le clone muté a été ensuite électroporé avec une spCas9 et un gRNA visant un site PAM à 3 pb de la mutation muté et d’un ssODN correspondant à la matrice corrigée. La réversion de la mutation a été confirmée par séquençage Sanger. Les 2 clones d’iPSc mutés et revertant se sont avérés pluripotents après un marquage à la phosphatase alacaline, RT-qPCR et immunomarquage des ARN et protéines de pluripotence (Oct4, Nanog, Sox2, SSEA4). Les 2 clones sont capables de former les trois feuillets caractéristiques : ectoderme, mésoderme et endoderme. Enfin le caryotype des deux clones est exempt d’aberrations chromosomiques.

Les 2 clones d’iPS ont pu être différenciés en cardiomyocytes qui sont positifs pour l’a-actinine et la troponine T par immunofluroescence. Une cytométrie anti Troponine T a permis de montrer que ces 2 clones avaient des rendements de différenciations aux alentours de 75%.

Une paire isogenique de lignes de clone iPS d’un patient de HCM a été générée présentant la mutation MYH7 permettant d’établir un modèle pour l’étude cellulaire et moléculaire de l’HCM.

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